洁净实验室

洁净 实验室要求：

1实验室环境应清洁、卫生、安静，实验室内严禁吸烟和饮食。

2实验人员必须穿戴工作衣帽，工作服经常洗涤、消毒、保持清洁。

3操作前后或离开实验室必须用肥皂或消毒液洗手。

4发生菌液污染台面或地面，应立即用3％甲醛或5％碳酸等消毒液由外向内倾覆其上，1小时后再擦拭，如为破伤风梭菌，则应隔夜后再擦洗。

5工作衣、帽、口罩受到菌液污染时，应立即脱下使污染部位包裹在内部，高压灭菌后再清洗。

6如有传染性培养物污染手部，应先用75％乙醇棉球擦拭，再浸入0.1%新洁尔灭消毒液内泡手，然后再用肥皂及清水彻底洗干净。

7接种环（针），每次使用前后，必须通过火焰灭菌，冷却后方可接种培养物，接种带有蜡质、油质的培养物或菌苔残留多时，不应立即在火焰上灼烧，应先在内焰里将油质培养物烘干后再移至火焰上灭菌，以免活菌外溅污染环境及感染操作者。

8带菌的吸管应浸泡在5％甲酚消毒液内24h后取出清洗，带菌的试管或培养物应在121℃高压灭菌30分钟后再取出清洗。

9在接种霉菌、放线菌时应在铺有浸过消毒液的纱布上操作，防止孢子散落传播。

10废弃物的处理：

必须消除生物危害后，才能处理，一般使用高压蒸汽灭菌，也可以采用直接焚烧。

污染性锐器（如一次性针头）应灭菌后处理，注意避免锐器扎伤。

污染性可重复使用的材料（如平皿）应灭菌后清洗，宜使用不易破碎的材料。

工作服（含洁净工作服）应定期清洗，怀疑污染的工作服应灭菌后清洗，洁净工作服应灭菌后使用。

无菌操作要求：

无菌操作是指在无菌的环境条件下，使用无菌器材，防止微生物污染的操作技术。即保持待检样品在操作时不被污染，又要防止被检的微生物及阳性对照菌在操作中污染环境或感染操作人员。从事无菌及微生物操作的工作人员必须经过无菌技术及基础微生物学专业知识的学习及培训才具备上岗操作的资格，微生物专业检验人员也不应该频繁地变换工作岗位。

1.无菌室应每次使用前后用0.1%苯扎溴铵溶液或2％甲醛液擦拭工作台面及可能污染的死角，湿拖地面，打开无菌空气过滤器及超净工作台的开关30分钟，紫外线杀菌灯照射1小时。

2.操作人员用肥皂洗手后进入缓冲间换拖鞋，用75％乙醇棉球擦手，穿戴工作衣帽、口罩。将所需物品剥去牛皮纸及外包装，从传递窗移入操作间，再用0.1%苯扎溴铵溶液泡手后进入操作间，在乙醇（或煤气灯）火焰区（火焰高度3－5cm）操作。

3供试品表面消毒，如为安瓿先用砂轮划痕后用2％碘酒棉球擦拭，再用75％乙醇棉球擦拭、待干，也可以用消毒液浸泡消毒。

4操作者勿用嘴直接吸吹吸管，防止致病菌感染操作人员及口中的杂菌污染供试品。

5在无菌操作中切勿大幅度或快速动作、拖行，以免搅动空气中尘埃微粒。

6注射器如需回抽时，应对着火焰吸入无菌空气。

7所用的器材如培养基、稀释剂配制后经湿热灭菌121℃30分钟，吸管培养皿等均应洗涤，低湿，包扎后经干热灭菌160℃2小时才能使用。

消毒剂的质量控制

（一）消毒剂安全使用原则

1.正确选择消毒剂的种类，尽可能选择低毒、低残留的消毒剂。

2.正确选择使用浓度，确保消毒效果。

3.正确选择消毒方式，可以浸泡、擦拭或喷雾。

4严格掌握消毒时间。

5.定期更换，避免产生耐药性。

6.不联用和混合使用。

7消毒前，应进行清洁。

（二）消毒剂的种类

1.高效消毒剂（HLD）：能杀灭一切微生物（包括芽孢），常见的有过氧乙酸、甲醛、环氧乙烷和含氯消毒剂

2.中效消毒剂（ILD）：能杀灭抵抗力较强的结核杆菌和其他细菌、真菌和大多数病毒，常见的有乙醇、苯扎溴铵、碘酊和甲酚皂溶液等

3.低效消毒剂（LLD）：能杀灭除结核杆菌以外的抵抗力较弱的细菌以及抵抗力较弱的真菌（如念珠菌）和病毒（如流感病毒、艾滋病毒等），常见的有氯已定、三氯散和高锰酸钾等

消毒剂配制

1.根据消毒剂使用区域和对象的不同，将消毒剂分成3类，分别是：

第一类消毒剂，专用于普通实验区，仅用于物品外表面的消毒，常用的有聚维酮碘和石炭酸等；

第二类消毒剂，专用于洁净室的更衣室，仅用于佩戴手套的双手消毒，常用的有苯扎溴铵和75％乙醇；

第三类消毒剂，专用于无菌操作间，直接用于消毒直接接触药品的容器表面，也用于实验操作过程中的手部消毒和实验台面消毒，常用的有聚维酮碘溶液和75％乙醇。

2.配制

第一类消毒剂的配制方法：不需使用无菌器具，可直接在普通实验区按消毒剂使用说明书的配制方法，用纯化水稀释消毒剂的浓溶液后使用。

第二类消毒剂的配制方法：不需使用无菌器具，应在更衣室内按消毒剂使用说明书的配制方法，用纯化水稀释消毒剂的浓溶液后使用。

第三类消毒剂的配制方法：需要使用无菌器具并在无菌操作间内配制。首先取一次性集菌过滤器一个，将排液口放置在灭菌过的锥形瓶上，将消毒剂浓溶液通过薄膜过滤的方式除菌。然后，按比例取灭菌后的纯化水，稀释浓溶液，制成可供使用的消毒剂。将此消毒剂倒入放置有无菌脱脂棉球的消毒剂缸中，得到可直接使用的消毒剂棉球。（该类消毒剂制备后，应收集消毒剂中的微生物）

环境监控

（一）目的：

确定工作台面、设备表面的消毒效果和消毒频次，确定洁净室的综合性能以及进行维护的时机，确定培养箱的污染情况，判断是否有必要进行彻底消毒。

（二）环境监控的对象

1.样品贮存的环境

2.培养基制备的环境

3.样品制备和检验的环境

4.培养的环境

（三）环境监控的方法

1.表面微生物数

擦拭法（棉拭子法）

淋洗法

影印盘法（RODAC法）

2.空气微生物数

沉降菌法 浮游菌法

浮游菌数的测定：采用浮游菌测定仪。

沉降菌数测定：方法：无菌室及净化工作台面消毒擦拭后，打开层流净化装置及净化工作台开关30min，将营养琼脂平板3个及玫瑰红钠琼脂平板3个（直径9cm），置净化工作台左、中、右各1个，开盖暴露30min后将盖盖上，分别放在30－35℃培养箱内培养48h及25－28℃培养箱内培养72h，细菌和真菌平均菌落数小于等于1个为100级。实验室一旦被污染，洁净度达不到要求，可以清洗或更换净化工作台过滤器，用甲醛或丙二醇、乳酸熏蒸消毒，方法：在支架上放一个烧杯（内装少许甲醛，8ml／平方米），下面放一个装有少许乙醇的乙醇灯，点燃后，关闭门窗，乙醇用尽后灯自灭，甲醛蒸气充满无菌室，密闭24h。

缺点：甲醛蒸气易锈蚀仪器，对人有刺激，可用氨水喷雾中和，减少对人眼的刺激。

环境监控的评价指标

1.表面微生物数

1.1需氧嗜温菌小于5cfu/cm2，合格

1.2需氧嗜温菌在5～25cfu/cm2之间，需进一步调查

1.3需氧嗜温菌大于25cfu/cm2，不合格，应立即消毒处理

2.空气微生物数

沉降菌大于15cfu/板，应暂停工作，进行消毒